BODIPY染料的母核反应:自噬过程中新酸化细胞器的实时监测

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BODIPY染料的母核反应:自噬过程中新酸化细胞器的实时监测

发布时间:2020-02-12浏览次数:11

  自噬是细胞内的一种自食(Self-eating)的现象。细胞可以通过自噬和溶酶体,消除、降解和消化受损、变性、衰老和失去功能的细胞、细胞器和变性蛋白质与核酸等生物大分子。为细胞的重建、再生和修复提供必须原料,实现细胞的再循环和再利用。自噬在机体的免疫、感染、炎症、肿瘤、心血管病、神经退行性病的发病中具有十分重要的作用。新酸化的细胞器与自噬过程密切相关,自噬过程本身构成了不同代谢途径的复杂相互作用。例如,自噬体可以与内吞途径的细胞器融合(早期/晚期内体,多囊体),产生比自噬体更酸性的结合体。同时,随着内体沿着内吞途径成熟,它们通常变得更酸性(晚期内体的pH约为5.0-5.5,早期内体的pH约为6.0-6.8)。因此,对细胞器酸化的实时成像对于更全面地了解自噬过程具有重要意义。标准的检测方法是通过电镜看到膜状结构的自噬体以及其他相关亚细胞结构。然而,电子显微镜需要化学固定的死细胞。活细胞成像可通过转染内体特异性蛋白基因的方法来实现。但是,这些方法需要相对较长的协议和复杂的操作步骤,同时效率低下。已经开发的荧光探针主要用于标记长寿命的酸性细胞器(如溶酶体)。通常遵循的一般策略是设计在此类细胞器中积累的探针。但是,这些探针通常不允许追踪新酸化细胞器的实际形成。超敏pH纳米探针,在研究内吞作用和纳米颗粒的细胞内运输的机理研究中可以发挥重要作用,但是无效的细胞内递送问题在很大程度上阻碍了它们的应用。对于自噬途径中晚期内体和其他酸化细胞器的标记,小分子荧光探针在这里更具前景,因为它们通常具有生物相容性,并且通常具有好的膜渗透性。用于酸性细胞器的荧光探针通常由具有亲脂性、弱碱性的荧光团组成,该部分使探针具有亲酸性,并在质子化时促进其在酸性囊泡中的积累。但是,如上所述,该策略不适用于新酸化的细胞器。当细胞与分子探针一起孵育时,标记了长寿命的溶酶体而不是新酸化的细胞器。这是因为一旦在酸性细胞室内质子化,带净正电荷的探针就无法轻易穿过细胞器的膜回到细胞质中。因此,溶酶体外部的探针浓度通常比溶酶体内部的探针浓度低一两个数量级,从而在实验过程中无法原位染色新酸化细胞器。因此,实时监测新酸化的细胞器的关键是将不可见、无荧光形式的分子探针作为“睡眠剂”“走私”到细胞中,并使它们均匀分布在细胞质和细胞器中,以便“唤醒”,即,当细胞器酸化时会转变为另一种可见的荧光形式。

  基于这种设计思路,大奖888官化学机构配位化学国家重点实验室的沈珍教授课题组开发了一种基于BODIPY母核反应的新型荧光探针。通过在BODIPY的3,5-位上修饰了强吸电子基团,使得探针的中位碳原子容易受到弱的亲核试剂(甲醇或水)进攻,导致母体的π共轭度丧失而形成无色且不发光的leuco-BODIPY形式,在酸性条件下可逆转变为具有强红色荧光的BODIPY形式,两种形式之间的光谱变化超过200 nm。活细胞成像实验发现在酸性细胞器或酸化的细胞质中显示出强烈的红色荧光,而在细胞的其他区域则几乎无荧光。这种快速的可逆变换加上可忽略的细胞毒性使得探针可以同时进行快速、直接的细胞内溶酶体成像和胞质酸中毒检测,且无需任何洗涤步骤,从而能够在自噬过程中实时监测新酸化的细胞器(图1)。

  该工作以“Real-time monitoring of newly acidified organelles during autophagy enabled by reaction-based BODIPY dyes”为题在线发表于Communications Biology (DOI:http://doi.org/10.1038/s42003-019-0682-1),并且被选为封面文章(Featured Image)。大奖888官网博士后刘汉壮和博士生宋文婷为本文共同第一作者,大奖888官网沈珍教授和德国联邦材料与化学研究所的Knut Rurack博士为共同通讯作者。此研究得到了国家自然科学基金(21771102)的经费资助。



图1. 溶酶体和新酸化细胞器的探针。 a) BODIPY母核的主要共振结构。 b) CH2Cl2中的BODIPY形式与MeOH中的Leuco-BODIPY形式之间的可逆转化,以及自噬过程中产生的信号传导应答。